En la búsqueda de espermatozoides sanos, maduros y estructuralmente apropiados para la fecundación, investigadores de la Universidad Nacional de Río Cuarto desarrollan hidrogeles capaces de seleccionar las células espermáticas sanas de una muestra de semen. Aunque trabajan con espermatozoides de bovinos, equinos y cerdos, la plataforma biotecnológica en desarrollo podrá ser empleada en humanos.

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Es un método innovador, eficiente y de bajo costo que permite la selección de los gametos masculinos de mayor calidad fertilizante para su uso en técnicas de reproducción asistida. Los avances de este conjunto de técnicas y procesos constituyen la base para esta plataforma con aplicación en la reproducción asistida en animales domésticos y el hombre a través de la producción de biomateriales capaces de seleccionar células espermáticas con mejor capacidad fertilizante.

La mayoría de las técnicas de fertilización asistida obvian la selección espermática que se produce naturalmente en el tracto femenino, lo que explica, en parte, su baja eficiencia. En respuesta a ese déficit, los científicos locales desarrollan y evalúan superficies poliméricas sintéticas en las que quedan adheridos los mejores espermatozoides. Y estudian aspectos morfológicos y fisiológicos de la población que queda pegada en esos hidrogeles, que funcionan como soportes altamente eficientes para unir espermatozoides con alta viabilidad, motilidad y baja alteración en su material genético y, por lo tanto, mejor capacidad fertilizante.

Este método permite desarrollar una técnica de separación y selección de esperma con altas tasas de viabilidad y menor daño en su material genético. Se sabe que el manejo de los espermatozoides como parte de los métodos de selección conduce a un incremento en estrés oxidativo. Se producen ciertas moléculas derivadas del oxígeno que dañan las membranas. Es un proceso natural, pero que puede aumentar a causa de la manipulación. Eso, en una muestra de espermatozoides, baja la calidad.

Puesto que no hay precedentes de uso de hidrogeles para el reclutamiento de los mejores gametos masculinos, constituye un aporte novedoso el de este equipo de investigación encabezado por el doctor Pablo Bosch, del Departamento de Biología Molecular de la Facultad de Ciencias Exactas.

Trabajan con espermatozoides de especies ganaderas de interés productivo en esta primera instancia y a futuro planean hacerlo con células espermáticas humanas para su uso en técnicas de reproducción asistida.

Adheridos a la superficie y con movimientos enérgicos

Participan investigadores de los departamentos de Química y Biología Molecular de la Facultad de Ciencias Exactas, Físico-Química y Naturales, y de Reproducción Animal de Agronomía y Veterinaria. Es un grupo interdisciplinario abocado a aplicar conocimientos del área de la físico-química de materiales al desarrollo de herramientas para la selección de gametos masculinos con el fin de mejorar la performance reproductiva de los machos.

Con la llegada de la reproducción asistida, se han ido desarrollado diferentes estrategias para separar al esperma del líquido seminal y seleccionar poblaciones con mejor capacidad fertilizante, muchas de ellas basadas en la motilidad y la vitalidad celular del semen. Se agregan métodos emergentes que se basan en la integridad y la madurez de la membrana espermática (carga eléctrica -potencial Z- de los espermatozoides y unión al ácido hialurónico) y ultra morfología espermática.

Además de los aspectos morfológicos y funcionales asociados con la calidad espermática, forman parte de los objetivos evitar tropiezos vinculados con alteraciones en la cromatina y fragmentación del ADN, que comprometen el desarrollo embrionario ulterior.

En experimentos preliminares hechos en los laboratorios de la UNRC, comprobaron que los espermatozoides se adhieren a los hidrogeles; particularmente, los que poseen carga neta positiva, lo cual concuerda con el potencial Z negativo que se sabe tienen los espermatozoides sobre su superficie. El potencial Z es la carga eléctrica o potencial eléctrico de la superficie. Los espermatozoides son negativos y tienden a adherirse a superficies que son positivas. A medida que van madurando, ese potencial Z es más importante.

Observaron una interacción fuerte entre los espermatozoides y la superficie del hidrogel; los espermatozoides permanecieron adheridos a la superficie y con movimientos enérgicos hasta doce horas desde el inicio del experimento.

Estos hallazgos son muy promisorios. El equipo de trabajo continúa investigando para comprender las características y los mecanismos que median en la interacción espermatozoide-hidrogel. El objetivo es el desarrollo de métodos nóveles para la selección de gametos masculinos con miras a su utilización en prácticas de reproducción asistida en animales de granja.

Primero, sintetizaron y caracterizaron físico-químicamente los compuestos poliméricos. Estos experimentos se llevaron a cabo en el Laboratorio de Investigación y Desarrollo de Materiales Avanzados de la UNRC, liderado por el doctor César Barbero. La segunda etapa se realiza en el Laboratorio de Biotecnología Animal, dirigido por el doctor Pablo Bosch y la doctora Nancy Rodríguez; y en el Departamento de Reproducción Animal de Agronomía y Veterinaria, bajo la dirección de la doctora María Isabel Vázquez.

Reemplazo de la selección natural

El eyaculado contiene una población heterogénea de células espermáticas con diferente capacidad fertilizante. El tracto reproductor de la hembra se comporta como un tamiz, ya que permite seleccionar los espermatozoides mejor dotados para fertilizar y llevar a término la preñez. Además de las barreras naturales del tracto femenino que deben ser sorteadas por los espermatozoides, se ha descripto en todas las especies de mamíferos estudiados la formación de un reservorio de espermatozoides en la porción posterior del oviducto. La interacción molecular entre espermatozoides y las células epiteliales del oviducto explican en gran medida la formación del reservorio. A partir de esta región, los espermatozoides se liberan gradualmente alcanzando el sitio de fertilización. Solo las células espermáticas morfológicamente normales y con alta capacidad para fertilizar el ovocito interactúan con las células del oviducto. Las técnicas de fertilización asistida no hacen la selección espermática que se produce naturalmente en el tracto femenino, lo cual puede hacerse de manera económica y simple a través de estos hidrogeles producidos en la UNRC.

No producen daños a los espermatozoides y tienen bajo costo

En la UNRC vienen trabajando en esta temática desde hace dos años y medio. Y han comprobado que los hidrogeles son no tóxicos para los espermatozoides, además de económicos y fáciles de fabricar. Ya se ha constatado que a partir de una muestra de semen pueden seleccionarse los mejores espermatozoides, de acuerdo con su motilidad –velocidad y tipo de movimiento– y viabilidad –células vivas–. Analizar la viabilidad es comprobar que el espermatozoide esté vivo. Para ello usan un colorante. Si la membrana del espermatozoide está íntegra este colorante no ingresa; mientras que cuando se daña la membrana el líquido de contraste ingresa y los espermatozoides se ven en el microscopio teñidos. El paso siguiente es hacer fertilización.

Pablo Bosch, doctor en Fisiología y Farmacología, título que obtuvo la Universidad de Georgia, USA, dio detalles de esta metodología de selección espermática. Dijo: “Son polímeros que en contacto con un medio acuoso absorben gran cantidad de agua y se forma un hidrogel. Nosotros utilizamos esos hidrogeles, que tienen cierta similitud con los tejidos vivos, para seleccionar espermatozoides de animales domésticos. Es parecido a la sustancia que está entre las células en todos los tejidos”.

“Estamos probando distintas superficies, diferentes tipos de hidrogeles y estudiando cómo se produce la interacción entre los espermatozoides y el hidrogel. Se pone la muestra de espermatozoides en contacto con el hidrogel en un medio acuoso, in vitro. Se trabaja con semen fresco, recién recolectado del macho, o con semen que ha sido preservado, en nitrógeno líquido”.

“A la muestra la lavamos con medios de cultivo. La diluimos, luego la centrifugamos para que los espermatozoides se acumulen en el fondo del tubo y descartamos solamente el medio. Esto lo repetimos una o dos veces para lavar los espermatozoides”, comentó.

Bosch explicó: “Se hace un proceso de síntesis de los hidrogeles. Requiere utilizar los monómeros, luego polimerizarlos en el laboratorio. Y, una vez que tenemos los hidrogeles, debemos conocer cuáles son las características físico-químicas. Se mide la cantidad de agua que son capaces de absorber, entre otras determinaciones. No sólo los probamos con agua, sino también con los medios de cultivo que se van a utilizar en los experimentos con el material biológico, los espermatozoides”.

Y remarcó: “Hemos realizado experimentos de citotoxicidad hechos con células, para ver cómo las afectan y se ha comprobado que los hidrogeles no son tóxicos para dichas células en cultivo. A eso se agrega que son económicos y relativamente sencillos de sintetizar”.

“Es un trabajo interdisciplinario, con gente del Departamento de Química, del grupo del doctor César Barbero y la doctora Claudia Rivarola, que se dedica al desarrollo de los materiales; también en colaboración con el Departamento de Reproducción Animal de la Facultad de Agronomía y Veterinaria, e investigadores del Departamento de Biología Molecular”, agregó.

Luego, puntualizó: “El macho eyacula una población de espermatozoides que es muy diversa, heterogénea. Naturalmente, se da un proceso de selección en el tracto genital de la hembra. Hay barreras físicas y bioquímicas que hacen que los mejores espermatozoides lleguen a donde se va a producir la fecundación. Cuando se usan técnicas de reproducción asistida eso no ocurre”.

“Hay varios métodos para seleccionar espermatozoides; algunos deterioran la calidad de los espermatozoides o impiden que se obtengan cantidades importantes. Nosotros estamos desarrollando este trabajo con hidrogeles, que nos permite obtener más espermatozoides seleccionados para técnicas de reproducción asistida”.

Por otro lado, Pablo Bosch agregó: “Lo de la selección de espermatozoides con hidrogeles es nuevo. A los hidrogeles les podemos agregar otras moléculas de origen biológico a las cuales los espermatozoides se adhieren. Hemos trabajado con semen fresco de equinos. Y con semen de cerdo, diluido –porque para esta especie no existen técnicas apropiadas para congelarlo en nitrógeno líquido; sólo puede ser conservado a 15º-17 º por unos 5-7 días–, el cual nos provee de un centro de inseminación artificial de la zona. En equinos hemos hecho experimentos con semen fresco y congelado. Y con bovinos con semen congelado”.

“Los espermatozoides tienen una carga negativa. Tienden a adherirse sobre superficies que son positivas. Cargas opuestas se atraen y se adhieren. Cuando ponemos una muestra, vemos a través del microscopio que una parte se adhiere a la superficie de estos hidrogeles. Luego de sintetizados, forman una delegada película adherida a la superficie de vidrio. Así podemos comprobar mediante observación microscópica que los espermatozoides se adhieren a la superficie y se mueven. Hemos realizado estudios de calidad espermática tanto de los que se adhieren como de los que no lo hacen. Y se ha comprobado que los primeros tienen mejores características que los segundos”, explicó el investigador, de vasta experiencia en biotecnologías reproductivas.

Trabajan con el gel adherido a un vidrio. Ahora, el paso siguiente es usar los espermatozoides seleccionados para fertilizar ovocitos y hacer embriones, con lo cual se probará la capacidad de esos gametos para generar un embrión.

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También llevaron adelante la selección de los espermatozoides mediante la unión al ácido hialurónico. En este sentido, el doctor Bosch, señaló: “Dentro de los hidrogeles, que son polímeros, podemos incluir otras moléculas. Hemos hecho experimentos con ácido hialurónico, que es un polímero natural involucrado en procesos reproductivos, y forma parte de la sustancia intercelular. Y se ha visto que los espermatozoides se adhieren al ácido hialurónico”. Y agregó: “Observamos que a los hidrogeles a los que les agregamos el ácido hialurónico, aumentaban la capacidad para unir espermatozoides”.